LARUTAN STOK

Laporan Praktikum

Bioteknologi Tanaman

LARUTAN STOK

Nama                 : M.Y.Fadly

NIM                    : G111 11 029

Kelompok         : 1

Asisten                : Nursyamsi B

JURUSAN AGRONOMI

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

BAB I

PENDAHULUAN

     1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan.  Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.  Sterilisasi pada teknik kultur jarngan meliputi: Sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterilisasi bahan tanam. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan.

      Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf. Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi, peralatan gelas laboratorium, dan dekontaminasi untuk membunuh bakteri dengan menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi 121⁰ C selama kurang lebih 15 menit.

Selain itu media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Unsur yang berperan penting dan esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Media kultur tersebut terdiri dari unsur hara makro, mikro, sumber karbon (gula), vitamin dan asam amino serta zat pengatur tumbuh. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, agar, arang aktif, bahan organik .Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca Senyawa tersebut mempunyai arti penting untuk kelangsungan pertumbuhan tanaman yang dibudidayakan secara invintro (kultur jaringan).  Ada dua penggolongan media tumbuh yaitu media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar dan nutrisi dicampurkan pada agar. Sedangkan media cair adalah media dengan nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair digunakan untuk tujuan tertentu seperti pembentukan Protocorm Like Body (PLB) pada anggrek dan jahe. Faktor lain yang perlu diperhatikan pada media cair atau padat adalah Derajat Keasaman atau pH dari media kultur. Sel tanaman membutuhkan pH antar 5,5 sampai 5,8 oleh karena itu media harus diatur pHnya agar sesuai dengan pertumbuhan sel tanaman.

  Media kultur in vitro juga memerlukan pertimbangan tertentu dalam campuran mineral, gula, vitamin dan hormon tumbuh. Sebagai contoh untuk induksi pertumbuhan sel kalus media Murashige dan Skoog (MS) dapat ditambahkan hormones auksin 2,4 D untuk induksi tunas dapat ditambahkan hormone IAA, sedangkan untuk pertumbuhan plantet dapat ditambahkan IAA dan Kinetin pada media MS lengkap. Semua media MS hasil modifikasi dengan penambahan hormon atau vitamin tertentu dapat dibuat dalam bentuk cair maupu padat dengan menambahkan bahan pemadat seperti agar, ekstrak kentang dan ekstrak pisang. Kemudian jika media kultur telah dipastikan siap, maka teknik kultur jaringan siap dilakukan.

Metode kultur in vitro dalam bidang pertanian saat ini telah berkembang untuk usaha perbanyakan tanaman, perbaikan sifat atau seleksi, produksi bahan metabolit, pemeliharaan plasma nutfah dan transfer gen dalam biologi molekuler. Semua kegiatan tersebut memerlukan media buatan baik dalam bentuk cair maupun padat dengan memberikan formulasi kebutuhan nutrisi, protein dan hormon tumbuh dalam perbandingan yang sesuai. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik kultur organ tanaman.

Bagian atau organ tanaman secara umun terdiri dari akar, batang, daun serta bagian reproduktif yang berupa bunga, buah atau biji. Bagian-bagian tanaman tersebut mampu untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap baik secara langsung maupun tidak langsung. Peristiwa ini terjadi karena tanaman mempunyaicsifat totipotensi sel, yaitu dalam satu sel mempunyai kemampuan untuk menjadi tanaman lengkap. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

Macam-macam organ umumnya menunjukan kecepatan pembelahan sel yng berbeda pula. Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam kultur in vitro antara lain mencakup genotip sumber bahan tanaman, media dan ZPT yang digunakan, kondisi lingkungan inkubasi, fisiologi jaringan dari eksplan secara optimal sehingga diperoleh tanaman lengkap. Kultur organ dengan bahan eksplan berupa pucuk tanaman yang sehat dan bebas virus mempunyai aspek praktis sebagai perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit.

            Maka dari itu, praktikum Pembuatan Larutan Stok perlu dilakukan untuk mengetahui cara pembuatan media MS dan VW. Selain itu, perlu pengmatan mengenai hasil pembuatan larutan stok pasca pembuatan.

1.2 Tujuan dan Kegunaan

            Praktikum ini bertujuan untuk Mengetahi cara membuat larutan stok pada kultur jaringan tanaman.

            Adapun kegunaan dari praktikum ini adalah mahasiswa dapat mempraktikkan secara langsung pembuatan larutan stok dalam hal ini media MS dan VW kemudian dilakukan pengamatan perubaha yang terjadi pada larutan tersebut.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Media kultur merupakan salah satu faktor penentukeberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang di kulturkan.  Adapun jenis media dalam kultur jaringan dapat dibedakan menjadi beberapa macam, antara lain :

1.      Media Murashige and Skoog (1962) dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada herbaceous.

2.      Medium Knop digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel.

3.      Media Vacin and Went biasa digunakan untuk tanaman anggrek.

4.      Media Knudson untuk kelapa kopyor dan anggrek.

5.      Media White (1934) dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor  Helianthus, sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat.

6.      Media Nitsch menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yangcukup tinggi untuk mengkultur jaringan tanaman artichoke Jerussalem.

7.      Media Gamborg B5 untuk kultur sel kedelaih.Media Schenk and Hildebrant (1972) cocok untuk kuljar tanaman monokotil. (Hendrayanto, 2003).

8.      Media Woody Plant Medium, diperuntukkan khusus untuk tanaman berkayu dan dikembangkan oleh ahli lai, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat dari media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.

9.      Media N6 untuk serelia terutama padi, media ini mempunyai ciri perbandingan NH4+ dan NO3- yang jauh perbandingannya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH4)SO4 hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO3 2830 mg/l. (Anonymous a, 2012).          

Adapun komposisi dan fungsi unsur-unsur dalam media MS (Murashige & Skogg), media MS, SH dan B5 merupakan media yang kaya garam-garam makro. Berikut penjelasan dari masing-masing komposisi media tersebut :

a. Hara Makro

Media kultur harus mengandung sedikitnya 25-60 mm nitrogen anorganik untuk pertumbuhan sel tanaman. Sel-sel tanaman mungkin dapat tumbuh pada sumber N dari nitrat saja, tetapi diketahui bahwa pertumbuhan yang lebih baik adalah apabila mengandung nitrat dan amonium. Apabila nitrat dan amonium sebagai sumber nitrogen digunakan bersama dalam media maka ion-ion amonium akan digunakan lebih cepat dibandingkan dengan ion-ion  nitrat. Kalium dibutuhkan untuk pertumbuhan sel bagi sebagian besar spesies tanaman. Konsentrasi yang lebih tinggi dari hara-hara tersebut mungkin diperlukan jika terjadi defisiensi dari hara yang lain.

b. Hara mikro

Unsur hara makro yang paling dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dan jaringan tanaman mencangkup besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), terusi (Cu) dan molibdenum (Mo). Besi yang digunakan dalam pembuatan media media harus dalam bentuk yang ter"chelate". Besi adalah yang paling kritis diantara semua hara mikro. Besi sitrat dan tartrat dapat digunakan untuk media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk larut dan biasanya akan terpresipitasi setelah media dibuat. Masalah ini dipecahkan oleh Murashige dan skoog dengan meng"chelate" besi dengan menggunakan asam etilen diamintetraasetik (EDTA).

c. Karbon dan Sumber Energi

Sumber karbohidrat yang biasanya digunakan dalam media kultur adalah sukrosa. Glukosa dan fruktosa dalam beberapa hal dapat digunakan sebagai pengganti sukrosa, dimana glukosa mempunyai efektivitas yang sama dengan sukrosa dibandingkan dengan fruktosa. Karbohidrat harus tersedia dalam media kultur karena sangat sedikit sel dari jenis tanaman yang diisolasi dapat bersifat autotropik, yaitu kemampuan menyediakan karbohidrat sendiri melalui asimilasi CO2 selama proses fotosintesa. Sukrosa dalam media kultur  secara cepat akan diurai menjadi fruktosa dan glukosa. Glukosa adalah yang pertama digunakan oleh sel, diikuti oleh fruktosa. Saat media disterilisasi dengan autoclave, sebagian sukrosa akan mengalami hidrolisa. Apabila sukrosa yang diautoklave ada bersama komponen media lain maka proses hidrolisa lebih besar. Kultur dari beberapa spesies tanaman akan tumbuh baik pada media yang sukrosanya diautoklave dibandingkan dengan media yang sukrosanya disterilisasi dengan filter. Hal ini dimungkinkan akan menguntungkan sel-sel karena tresedianya glukosa dan fruktosa. 

d. Vitamin

Meskipun vitamin-vitamin tersebut bukan faktor pembatas pertumbuhan, tetapi sering memberikan keberhasilan dalam kultur sel dan jaringan tanaman. Biasanya penambahan vitamin-vitamin tersebut ke dalam media dilakukan apabila konsentrasi thiamin dianggap di bawah taraf yang diinginkan atau apabila jumlah populasi sel-sel yang tumbuh masih rendah.

e. Asam amino dan sumber nitrogen lainnya

Sumber nitrogen organik yang paling banyak digunakan dalam media kultur adalah asam amino campuran (casein hidrolisat), L-glutamin, L-asparagin, dan adenin. Adenin sulfat juga sering ditambahkan pada media kultur yang fungsinya dapat menstimulir pertumbuhan sel dan meningkatkan pembentukan tunas.

f. Bahan organik kompleks

Arang aktif (activated charcoal) juga sering digunakan pada media kultur. Beberapa hasil penelitianmenunjukkan pengaruh yang menguntungkan dan juga dapat merugikan. Pada kultur beberapa tanaman seperti anggrek, bawang, wortel dan tomat dapat menstimulir pertumbuhan dan diferensiasi, tetapi pada kultur tanaman tembakau, kedelai dan teh justru akan menghambat pertumbuhan. Pengaruh arang aktif umumnya diarahkan dari salah satu tiga hal berikut : penyerapan senyawa-senyawa penghambat, penyerapan ZPT atau menggelapkan warna media. Arang aktif dapat menstimulasi pertumbuhan sel umumnya karena kemampuan arang aktif mengikat senyawa fenol yang bersifat toksik. Konsentrasi arang aktif yang ditambahkan kedalam media kultur umumnya sebanyak 0,5-3 %. 

g. Bahan Pemadat dan Penyangga Biakan           

Media kultur tanaman dapat dibuat padat atau semi padat, yaitu dengan penambahan bahan pemadat berupa agar.

h. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)

Terdapat empat klas zat pengatur tumbuh (ZPT) yang penting dalam kultur jaringan tanaman, yaitu : auksin, sitokinin, giberelin dan asam absisik. Skoog dan Miller adalah yang pertama melaporkan bahwa perbandingan auksin dan sitokinin menentukan jenis dan berapa besar proses organogenesis dalam kultur jaringan tanaman, Auksin dan sitokinin yang ditambahkan kedalam media kultur mempunyai tujuan untuk mendapatkan morfogenesis, meskipun perbandingannya untuk mendapatkan induksi akar dan tunas bervariasi baik ditingkat genus, spesies bahkan kultivar (anonymous b, 2012).

Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih besar dari konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media akan dibuat. (Hemawan dan Na’em, 2006)
Cara perhitungan kebutuhan media dan larutan stok disajikan pada rumus di bawah ini. dan hasilnya secara lengkap pada tabel di bawah ini. Tabel ini menyajikan  macam-macam larutan stok yang sebaiknya ada pada pembuatan media MS, pengelompokan bahan-bahan penyusun larutan stok, perhitungan kebutuhan bahan-bahan untuk pembuatan larutan stok per 10 liter media, ukuran volume wadah untuk tempat larutan stok, perhitungan konsentrasi masing-masing stok, dan banyaknya pengambilan (volume) larutan stok yang diambil untuk keperluan pembuatan media 1 liter. Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat menggunakan rumus (Hemawan dan Na’em, 2006) :

V1 x M1 = V2 x M2

Dimana:

V1 = volume yang akan dibuat
M1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media MS
V2 = volume larutan stok yang akan diambil
M2 = banyaknya senyawa dalam larutan stok

BAB III

BAHAN DAN METODE

3.1 Tempat dan Waktu

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Biosains Terapan Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Hasanuddin, Makassar pada tanggal 18 Oktober 2013, pukul 9.45 – 17.30 WITA.

3.2 Bahan dan Alat

            Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini diantaranya aquades,  untuk media MS meliputi komposisi senyawa :

1.      Senyawa makro KNO₃, KH₂PO₄, CaCl₂.2H₂O, MgSO₄.7H₂O

2.      Senyawa mikro H₃BO₃, KI, Na₂MoO₄.2H2O, CoCl₂.6H2O, MnSO₄.4H2O, ZnSO₄.4H2O, CuSO₄.5H2O

3.      Zat besi Na₂EDTA dan FeSO4.7H2O

4.      Vitamin Myo-inositol, Glisin, Piridoksin-HCl

Untuk media VW meliputi komposisi senyawa :

1.      Stok B KNO₃

2.      Stok C KH₂PO₄

3.      Stok D MgSO₄.7H₂O dan MnSO₄.4H₂O

4.      Stok E (Ca₂)3PO

Adapun alat-alat yang dipakai diantaranya timbangan, aluminium foil, hot plate, magnetic stirrer, autoclave, batang pengaduk, tabung Erlenmeyer, botol stok.    

3.3 Prosedur Kerja

            Adapun prosedur kerja dari praktikum ini yaitu :

1.      Menyiapkan alat dan bahan.

2.      Mensterilisasi aquades dalam botol-botol steril yang ditutup menggunakan aluminium foil, kemudian dimasukkan ke dalam autoclave.

3.      Menimbang masing-masing bahan yang akan digunakan sesuai dosis.

4.      Mencampur masing-masing bahan yang telah ditimbang berdasarkan komposisi stok, senyawa makro, mikro, vitamin, maupun zat besi dengan aquades pada tabung erlenmeyer.

5.      Memanaskan dan menghomogenkan larutan menggunakan autoclave dan magnetic sterrer.

6.      Setelah semua larutan dingin, kemudian dilanjutkan dengan memasukkan larutan tersebut ke dalam botol stok masing-masing, dan untuk botol zat besi ditutupi ditutupi dengan aluminium foil agar tidak terkena cahaya secara langsung.

7.      Memasukkan semua botol berisi larutan ke dalam kulkas.

8.      Mengamati setiap larutan dalam botol dengan parameter warna dan apakah ada pengendpan atau tidak.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

            Hasil pengamatan mengenai perubahan larutan pada masing-masing botol disajikan pada Tabel 1.

            Tabel 1. Hasil pengamatan larutan stok

No.	Jenis Stok	Hari setelah Pembuatan	Mengendap/Kontaminasi/Berubah Warna
1.	Makro MS	5	-
2.	Makro VW	4	-
3.	Vitamin MS	8	-
4.	Mikro MS	8	-
5.	Stok B VW	8	Endapan kristal
6.	Stok C VW	8	-
7.	Stok D VW	8	-
8.	Stok E VW	8	Endapan putih

4.2              Pembahasan

Berdasarkan hasil di atas, dapat kita lihat bahwa dala pembuatan larutan stok untuk kultur jaringan diperlukan teknik khusus salah satunya dalam pencampuran senyawa-senyawa dan massa dari senyawa-senyawa tersebut.

Pada pencampuran senyawa-senyawa kimia harus sesuai atau tepat dosis dengan perhitungan yang dilakukan sebelumnya. Dalam penyimpanan larutan stok B VW dan E VW di dalam botol terdapat pengendapan, dikarenakan kepekatan larutan yang salah akibat pencampuran bahan yang kurang sesuai. Hal ini sesuai dengan pendapat Gunawan (1988) yang menyatakan bahwa pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan larutan terlalu tinggi. Di lain sisi, juga diketauhi pada pencampuran senyawa-senyawa kimia harus sesuai atau dengan perhitungan yang dilakukan sebelumnya. Dalam penyimpanan larutan stok B VW dan E VW di dalam botol terdapat pengendapan, dikarenakan kepekatan larutan yang salah akibat pencampuran bahan yang kurang sesuai.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum Seed Priming, dapat disimpulkan :

1.      Dalam pembuatan larutan stok, senyawa-senyawa dikelompokkan berdasarkan senyawa makro mikro atau berdasarkan stoknya masing-masing.

2.      Pada stok B VW dan D VW terjadi pengendapan akibat kepekatan larutan yang kurang seuai.

5.1.Saran

            Sebaiknya, dalam praktikum ini digunakan massa atau konsentrasi senyawa yang sesuai agar tidak terjadi pengendapan pada botol stok.

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan, L.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan, PAU Bioteknologi, IPB.

Hendaryono, Sriyanti dan Wijayani, Ari . 1994 . Teknik Kultur Jaringan . Penerbit Kanisius : Yogyakarta

Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.

Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.

Susilowati, Ari. Shanti Listyawati. 2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS. Jurnal Biodiversitas Volume 2 No. 1 hlm 110-114.